Badania

WŁAŚCIWOŚCI FARMAKOLOGICZNE SUBSTANCJI ZAWARTYCH W PREPARACIE VILCACORA (Uncaria tomentosa)

Badania nad niżej przedstawionymi substancjami prowadzone były przez naukowców z całego świata i zostały opisane w odpowiednich opracowaniach.

Główne alkaloidy oksoindolowe i indolowe zawarte w Uncaria tomentosa:

• speciofilina
• ukaryna F
• pteropodyna
• izopteropodyna
• akummigina
• tetrahydroalstonina
• - mitrafilina
• izomitrafilina

ALKALOIDY INDOLOWE

Hirsutyna

• blokuje komórkowe kanały wapniowe, hamując zależny od napięcia przpływ jonów wapniowych
• powoduje wazorelaksację o natężeniu podobnym do papaweryny, co badano w tętnicach, mózgowych i wińcowych psów
• wywołuje efekt hipotensyjny u szczurów
• in vitro jest silnym inhibitorem wirusa grypy typu A
• wykazuje zdolności ochronne w stosunku do śluzówki przewodu pokarmowego, zapobiegając powstawaniu indukowanych wrzodów żołądka u myszy
• wywołuje łagodny efekt przeciwskurczowy na jelita mysie
• ma równie silne jak ajmalina działanie antyarytmiczne w arytmiach indukowanych akonityną u myszy i w arytmiach indukowanych ouabainą u świnek morskich
• w ponad 60% blokuje wiązanie ligandów z receptorami alfa- i beta- adrenergicznymi, serotoninowymi 1A i 2
• w sposób dawkozależny hamuje indukowane glutaminianem drgawki u myszy, w Chinach rozważana jako lek przeciwpadaczkowy
• podawana dotkankowo wywołuje blokadę zwojów nerwowych i znieczulenie lokalne.

Hirsuteina

• zmniejsza wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapniowych hamując ich uwalnianie ze zbiorników wewnątrzkomórkowych i napływ do komórki przez kanały zależne od Ca2+
• wywołuje efekt hipotensyjny u szczurów
• w sposób dawkozależny hamuje indukowane glutaminianem drgawki u myszy, w Chinach rozważana także jako lek przeciwpadaczkowy
• niekompetycyjnie, w sposób dawkozależny hamuje uwalnianie dopaminy w wyniku pobudzenia receptora nikotynowego ze szczurzych komórek pheochromocytomalnych.

Dihydrokorynanteina

• jest silnym i selektywnym inhibitorem o częściowych właściwościach agonistycznych w stosunku do serotoniny (5-hydroksytryptaminy)
• wywołuje łagodny efekt przeciwskurczowy na jelita mysie
• ma działanie hipotensyjne u szczurów

ALKALOIDY OKSOINDOLOWE

Na podstawie wielu badań prowadzonych in vitro i in vivo można stwierdzić:

1. Pentacykliczne alkaloidy oksoindolowe oddziałują głównie na komórki układu immunologicznego, szczególnie odpowiedzialne za odporność nieswoistą i komórkową, zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio. Izomitrafilina, izopteropodyna i pteropodyna wykazują się właściwościami wzmagającymi aktywność fagocytarną w testach in vitro i in vivo.
2. Tetracykliczne alkaloidy oksoindolowe oddziałują głównie na układ nerwowy, ośrodkowy i obwodowy, a ostatnie badania wskazują, że oddziaływanie ich może być częściowo antagonistyczne w stosunku do alkaloidów pentacyklicznych.
3. Pentacykliczne alkaloidy oksoindolowe stymulują komórki śródbłonka naczyniowego do produkcji nieznanych na razie czynników stymulujących i regulujących proliferację prawidłowych ludzkich nieaktywnych limfocytów B i T, prowadzących do normalizacji zawartości procentowej frakcji limfocytarnych bez istotnych zmian ogólnej liczby limfocytów w jednostce objętości.
4. Pentacykliczne alkaloidy oksoindolowe hamują proliferację prawidłowych ludzkich limfoblastów i ludzkich nowotworowych linni limfoblastoidalnych B i T, bez powodowania efektu cytotoksycznego.

Wszystkie pentacykliczne alkaloidy oksoindolowe zawarte w vilcacorze oprócz mitrafiliny mają właściwości antyproliferacyjne w stosunku do białaczkowych linii komórkowych HL60 i U-937, nie hamując przy tym wzrostu prawidłowych ludzkich komórek progenitorowych krwi, przy czym największą aktywnością wykazuje się unkaryna F, z IC50 = 21,7-29 mikromol/l. Mechanizmem tego działania może być hamowanie aktywności polimerazy DNA, co udowodniono w badaniach in vitro ekstraktu Uncaria tomentosa. Alkaloidy oksoindolowe w niskich stężeniach nie mają silnych właściwości cytotoksycznych w stosunku do innych komórek nowotworowych.

Rynchofilina

• wywołuje efekt hipotensyjny, przy tym podawana szczurom łącznie z dihydralazyną hamuje przyspieszenie akcji serca w odpowiedzi na hipotensję.
• rozkurcza naczynia krwionośne
• ma działanie przeciwgorączkowe - przeciwzapalne
• działa łagodnie przeciwskurczowo na jelita
• stymuluje kurczliwość macicy
• pobudza aktywność oddechową
• blokuje zależne od napięcia kanały wapniowe.

Izorynchofilina

• wywołuje efekt hipotensyjny u szczurów
• wywołuje łagodny efekt przeciwskurczowy na jelita
• blokuje zwoje nerwowe
• działa depresyjnie na aktywność lokomotoryczną myszy, prawdopodobnie poprzez oddziaływanie z centralnym systememdopaminergicznym
• blokuje zależne od napięcia kanały wapniowe
• spowalnia pracę serca, działając na węzeł zatokowy i zwalniając przewodzenie przedsionkowo - komorowe; jest to działanie blokowane przez izoprenalinę, lecz nie przez atropinę.

Mitrafilina

• ma właściwości diuretyczne

INNE ZWIĄZKI

Niektóre glikozydy, w tym kwasu chininowego i triterpeny izolowane z chloroformowo - metanolowych ekstraktów vilcacory są związkaqmi o właściwościach przeciwwirusowych w stosunku do rhinowirusów i wirusa VSV (vesicular stomatitis virus). Mają one także właściwości przeciwzapalne, co badano w teście hamowania obrzęku wywoływanego karrageniną u szczurów.

Triterpeny: kwasy ursolowy i oleanowy mają właściwości antyoksydacyjne.

Kwas ursolowy wykazuje bardzo silne właściwości antyproliferacyjne i indukuje apoptozę w nowotworowych liniach komórkowych: A549 (ludzki rak płuca), SK-OV-3 (jajnika), SK-MEL-2 (skóry), XF498 (guz mózgu), HCT-15 (rak okrężnicy), SNU-1 (żołądka), L1210 (białaczki mysiej), B16-F-0 (czerniaka mysiego).

Ponadto kwas ten w ponad 60% blokuje wiązanie ligandów z receptorami muskarynowymi.

Sterole zawarte w vilcacorze (w ok. 60% beta sitosterol, ponadto stigmasterol kampesterol) cechują się działaniem przeciwzapalnym o umiarkowanym natężeniu.

Taniny i inne flawonidy wpływaj pozytywnie na motoryk jelit i dróg żółciowych, mają ponadto wartości smakowe u wielu osób pobudzające apetyt.

Flawonidy, w tym taniny katechinowe, znane są jako składniki używek (głównie herbaty) o właściwościach zapobiegających powstawaniu nowotworów, co udowodniono także w licznych próbach epidemiologicznych.

Katechinowe taniny są związkami o właściwościach antyoksydacyjnych, m.in. mogą chronić kwas askorbinowy (witaminę C) przed utlenianiem. Cis-epikatechina ma szczególnie silne właściwości antyoksydacyjne (przewyższające witaminę E) i działanie ochronne na naczynia krwionośne, przedłużając życie laboratoryjnym szczurom spontanicznie rozwijającym nadciśnienie, podatnym na domózgowe wylewy krwotoczne. Także rozpuszczalne w wodzie flawonidy - procyjanidyny mają działanie ochronne na naczynia krwionośne, właściwości przeciwzapalne, a także silne działanie antyoksydacyjne.

Badania kliniczne wykonane w Centrum Onkologii im. Blokhina, RAMN oraz Centrum Medycyny "YUNONA" w Moskwie doczekały się już opracowań naukowych. Oto tytuły prac oficjalnie ogłoszonych drukiem (są częścią opracowania patentowego);

E.M Treshalina, N.V. Getmanski, L.A. Sedakova, G.A. Firsova, G.K. Gerasimova: "Extracto de la Uncaria tomentosa en combinacion con los citostaticos. Materiales del III Congreso Nacional Ruso "El Hombre y la Medicina", Mosco 16 - 20 Abril, 1996"

V. Getmanskaia, L.P. Kovalenko, L.Iu. Telegin, B.A. Bayshtov, A.D. Durnev: "Efecto del Preparado Una de Gato producido sobre algunos parametros de immunidad de los ratones." Boletin Texiologico No 5 setiemre - octubre 1997.

E.A. Ostrakhovich, E.V. Mikhalchik, N.V. Getmanskaia, A.D. Durnev: "Aktividad anti oxydante del extracto de Uncaria tomentosa" Revista Quimico - Farmaceutica 6.

E.R. Pereverseva, E.M. Treshalina, N.V. Getmanskaia, L.A. Sedakova, G.A. Firsova, G.K. Gerasimova, D.A. Bodiaguin, I.D. Treshalin: "Laboratorio de Farmacologia Toxofarm S.A. Moscu 115446, Rusia

Departamento do Quimioterapia Experimental des Tumores, Centro Onkologico N.N. Blokhin, RAMN, Rusia Moscu, 115478 Centro de Medicina Popular "Yunona" Moscu 115477 Rusia.

Propiedades Toxomodificantes y Antitumorales del Extracto de Uncaria tomentosa. I Congreso de Oncologos de la Comunidad des Los Paises Independiantes. 3 - 6 dieciembre Moscu 1996.

Badania kliniczne wykonane w Centrum Onkologii im. Blokhina, RAMN oraz Centrum Medycyny "YUNONA" w Moskwie doczekały się już opracowań naukowych. Oto tytuły prac oficjalnie ogłoszonych drukiem (są częścią opracowania patentowego);

 

1. E.M Treshalina, N.V. Getmanski, L.A. Sedakova, G.A. Firsova, G.K. Gerasimova: "Extracto de la Uncaria tomentosa en combinacion con los citostaticos. Materiales del III Congreso Nacional Ruso "El Hombre y la Medicina", Mosco 16 - 20 Abril, 1996"

2. V. Getmanskaia, L.P. Kovalenko, L.Iu. Telegin, B.A. Bayshtov, A.D. Durnev: "Efecto del Preparado Una de Gato producido sobre algunos parametros de immunidad de los ratones." Boletin Texiologico No 5 setiemre - octubre 1997.

3. E.A. Ostrakhovich, E.V. Mikhalchik, N.V. Getmanskaia, A.D. Durnev: "Aktividad anti oxydante del extracto de Uncaria tomentosa" Revista Quimico - Farmaceutica 6.

4. E.R. Pereverseva, E.M. Treshalina, N.V. Getmanskaia, L.A. Sedakova, G.A. Firsova, G.K. Gerasimova, D.A. Bodiaguin, I.D. Treshalin: "Laboratorio de Farmacologia Toxofarm S.A. Moscu 115446, Rusia

1. Określenie względnej i absolutnej zawartości limfocytów T i B z ekspresją MKAT przez clasteres CD3 i CD19.

2. Określenie względnej i absolutnej liczby limfocytów pomocniczych (helperów) indukujących i limfocytów supresorów T w subpopulacjach CD3+, CD4+ i CD3, CD8+

3. Określenie stosunku helperów indukujących i supresorów T w subpopulacjach CD3+, CD4+ i CD3+, CD8+.

4. Określenie procesów aktywacji limfocytów poprzez analizę cytometryczną aktywnych receptorów funkcjonalnych.

5. Określenie zbiorcze liczby aktywowanych komórek T i limfocytów B obecnością HLA -

6. Określenie komórek aktywowanych i subpopulacji CD4+ i CD8+ poprzez obecność receptorów dla interleukiny-2 (CD 25) i dla transferyny (CD 71).

7. Określenie zmian we wczesnych etapach aktywacji limfocytów poprzez kanały wapnia i proporcji komórek

8. Określenie obecności receptorów IgE dla antygenów blastów B.

Departamento do Quimioterapia Experimental des Tumores, Centro Onkologico N.N. Blokhin, RAMN, Rusia Moscu, 115478 Centro de Medicina Popular "Yunona" Moscu 115477 Rusia.

Propiedades Toxomodificantes y Antitumorales del Extracto de Uncaria tomentosa. I Congreso de Oncologos de la Comunidad des Los Paises Independiantes. 3 - 6 dieciembre Moscu 1996.

 

 

APPENDIX 1

Anticancer Research 18: 3363-3368 (1998)

Indukcja apoptozy i zahamowanie proliferacji ludzkich komórek nowotworowych pod wpływem wyciągów z Uncaria tomentosa

Yezhou Sheng, Ronald W. Pero, Amir Amiri i Carl Bryngelsson Department of Cell and Molecular Biology, Section for Molecular Ecogenetics, University of Lund, Box 7031, S-220 07 Lund, Sweden

Skrót:

Zbadano in vitro działanie hamujące na wzrost komórek wywołane przez wodne wyciągi z Uncaria tomentosa (C-Med-100), do badań użyto dwie linie ludzkich komórek nowotworowych (białaczkowych) K562 i HL60 oraz linią ludzkich limfocytów B zmutowanych pod wpływem wirusa Epsteina-Barra (chłoniak) Raji. Zdolność do proliferacji komórek HL60 i Raji w obecności C-Med-100 uległa znacznemu zmniejszeniu w porównaniu z komórkami K562, które były oporniejsze na działanie wyciągu. Co więcej, metoda klonowania potwierdziła wpływ antyproliferacyjny wyciągów - zaobserwowano dużą współzależność między stężeniem C-Med-100 a liczbą komórek, które przeżyły. Wydaje się, że wpływ supresyjny Uncaria tomentosa na wzrost komórek odbywa się poprzez indukcję apoptozy. Wskazywały na to charakterystyczne zmiany morfologii DNA, jego wewnątrzjądrowa fragmentacja wykazana w elektroforezie na żelu agarowym oraz ocena ilościowa fragmentów DNA. C-Med-100 indukował apoptozę o opóźnionym charakterze, która stawała się najbardziej zależna od dawki wyciągu po 48 godzinach od podania. Pęknięcia w pojedynczych i podwójnych łańcuchach DNA wzrastały po 24 godzinach od podania C-Med-100, co sugerowało związek między uszkodzeniem DNA a apoptozą. Indukcja pęknięć DNA związanych z apoptozą może wyjaśniać zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych pod działaniem wyciągów z Uncaria tomentosa. Przedstawione wyniki są bezpośrednim dowodem na własności antynowotworowe Uncaria tomentosa, których mechanizm opiera się na wybiórczej indukcji apoptozy.

Skróty:

DMSO - dwumetylosulfotlenek; DSB DNA - pęknięcia podwójnego łańcucha DNA; PE - wydajność płytki; R10, RPMI 1640 - środowisko wzbogacone 10% osoczem płodów cielęcych; SSB DNA - pęknięcia pojedynczego łańcucha DNA; SF - współczynnik przeżycia.

Słowa kluczowe:

Uncaria tomentosa, apoptoza, proliferacja, klonowanie komórek, pęknięcia łańcucha DNA.

Uncaria tomentosa (Willd.) DC, jest stosowana w tradycyjnej medycynie południowoamerykańskiej. Indianie zamieszkujący dorzecze Amazonki używają herbat z kory lub korzeni tej rośliny w leczeniu różnych schorzeń takich jak: nowotwory, zapalenie stawów i choroby zakaźne. Wykazano, że wyciągi na rozpuszczalnikach organicznych z Uncaria tomentosa mają własności cytostatyczne, antykoncepcyjne i przeciwzapalne. Związki wyizolowane z tych wyciągów zwiększają fagocytozę i działają przeciwwirusowo, przeciwzapalnie i antymutagennie. Do tej pory istniało niewiele danych naukowych na temat działania antynowotworowego Uncaria tomentosa, choć w Internecie można odnaleźć kilka doniesień o leczeniu nowotworów tą rośliną.

Wiele związków uzyskanych z roślin znalazło zastosowanie w leczeniu nowotworów. Taksol, kamptotecyna, winblastyna i winkrystyna są jednymi z najważniejszych leków obecnie stosowanych w leczeniu nowotworów u ludzi. Związki te posłużyły jako modele w opracowywaniu nowych chemioterapeutyków. Do nowo odkrytych związków antynowotworowych pochodzenia roślinnego należą: kwas betulinowy jako wybiórczy inhibitor rozwoju ludzkiego czerniaka na drodze indukcji apoptozy i kombretastatyna A-4 wykazująca silne i wybiórcze działanie toksyczne w stosunku do układu naczyniowego guza nowotworowego. Ostatnio jest coraz bardziej oczywiste, że apoptoza (zaprogramowana śmierć komórki) okazuje się ważnym mechanizmem działania leczenia nowotworów takiego jak: naświetlanie oraz podawanie leków alkilujących - cisplatyna i 1,3-bis (2-chloroetylo) -1-nitrozomoczniki (BCNU), inhibitora topoizomerazy, czynnika martwicy nowotworu, taksolu i benzamidów z podstawionym atomem azotu jak metoklopramid i 3-chloroprokainamid. Celem przemysłu farmaceutycznego stało się opracowywanie leków powodujących indukcję apoptozy. Badaliśmy działanie antynowotworowe niskocząsteczkowych wodnych wyciągów Uncaria tomentosa na modelach komórkowych in vitro. W badaniach zastosowaliśmy najnowsze osiągnięcia biologii molekularnej niezbędne w poszukiwaniu leków przeciwnowotworowych.

Środki i metody

Środki: Koncentrat C-Med-100 został przygotowany z wodnych wyciągów C-Med-100 dostarczonych przez CampaMed. Inc., Arlington, Vermont. Wyciągi firmy CampaMed dializowano w wodzie destylowanej, a następnie zagęszczano do roztworu podstawowego o stężeniu 8 mg/ml użytego do wszystkich analiz. Środowisko RPMI 1640 i osocze płodów cielęcych (FCS) uzyskano z Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). Proteinazę K i RNAzę zakupiono od Sigma, Inc. Znacznik ciągu 100 par nukleotydów DNA uzyskano od Pharmacia BioTech, a filtry poliwęglanowe od Millipore. Amersham Life Science dostarczyło tymidynę znakowaną trytem (2 Ci/mmol).

Hodowla komórkowa - ludzkie komórki białaczki HL60 i K562 jak również komórki chłoniaka Raji hodowano w środowisku RPMI 1640 wzbogaconym 10% osoczem płodów cielęcych (R10) w inkubatorze w temperaturze 37 stopni C, w 80% wilgotności i w 5% CO2. Wszystkie komórki użyte w badaniach hodowano przez 2 dni w początkowym zagęszczeniu 2 x 10 5 , co spowodowało ich wykładniczy wzrost. Żywotność komórek oznaczona metodą barwienia trypanem blue wynosiła ponad 95%.

Proliferacja komórek oznaczona metodą mikromiareczkowania (MTT) - własności antyproliferacyjne C-Med-100 określono poprzez mikromiareczkowanie kolorymetryczne jak opisano to poprzednio (19). W skrócie: 10 µl kolejnych identycznych rozcieńczeń C-Med-100 dodano do 190 µl komórek HL60 (0,05 x 10 6 komórek/ml) w płaskodennych płytkach z 96 dołkami (Corning, NY), uzyskując stężenie C-Med-100 od 1,6 µg/ml do 400 µg/ml. Płytki inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni C, a następnie dodawano 20 µl roztworu do mikromiareczkowania (5mg/ml, Sigma) i inkubowano przez dodatkowe trzy godziny w temperaturze 37 stopni C. Pomiaru dokonywano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 540 nm po dokonanej lizie komórkowej w 150 µl DMSO i 25 µl 0,1-molowego buforu glicynowego (pH 10,5).

Synteza DNA określona przez wbudowywanie tymidyny znakowanej trytem - rosnące w sposób wykładniczy komórki zawieszono w nowym roztworze R10 w gęstości 0,05 x 10 6 /ml, umieszczono w płaskodennych płytkach z 96 dołkami z równą objętością, lecz różnymi stężeniami C-Med-100 (końcowe stężenie wahało się między 0 a 200 µg/ml) i hodowano w temperaturze 37 stopni C i w 5% CO 2 przez 3 dni. Następnie rozpoczęto inkubację z 1 mikro-kiurem tymidyny znakowanej trytem przez godzinę. Oznakowany nuklearnie materiał pozostał na filtrach o włóknach szklanych w zbiorniku z płytkami do mikromiareczkowania - po wysuszeniu rozpoczęto liczenie impulsów scyntylacyjnych w płynie dostarczonym przez Ready Safe, Beckman, USA.

Każdą próbkę badano czterokrotnie; wyniki przedstawiono jako wartości srednie, +/- odchylenie standardowe.

Morfologiczne pomiary apoptozy - komórek HL60 o gęstości 0,5 x 10 do szóstej/ml rutynowo hodowano przez trzy dni w R10 w temperaturze 37 stopni C, w 5% CO2, zanim zebrano je przez wirowanie i ponownie zawieszono w nowym środowisku w stężeniu 0,5 x 10 6 komórek/ml w 15 mililitrowych sterylnych pojemnikach SAR- -STEDT. Następnie komórki poddano działaniu C-Med-100 w stężeniu końcowym 0,397 mg/ml przez 3, 6, 24, 48 i 72 godziny w temperaturze 37 stopni C. Jako pozytywne kontrole zastosowano nadtlenek wodoru (50 µmoli) i naświetlanie promieniami gamma (5 Gy). Cytotoksyczność określono za pomocą procentu komórek uległych apoptozie i martwicy. Liczbę komórek z apoptozą obliczano na podstawie zmian morfologicznych (zagęszczanie chromatyny, kurczenie się, tworzenie się pęcherzyków z błon komórkowych, fragmentacja i pojawianie się “ciał apoptozy”) obserwowanych pod mikroskopem z kontrastem fazowym (powiększenie 400 x). Komórki martwicze wybarwiano trypanem blue.

Fragmentacja DNA oznaczana przy pomocy elektroforezy na żelu agarowym - 2 x 10 6 komórek inkubowano z C-Med-100 w różnych stężeniach przez 3 dni, następnie zawieszono w 0,25 µl buforu TE (10 milimoli Tris, 1 milimol EDTA, pH 8,0) i w 0,25 mililitrach buforu powodującego lizę (5 milimoli Tris, 20 milimoli EDTA, 0,5% Triton X-100, pH 8,0). Próbki mieszano, inkubowano w 4 stopniach C przez 30 minut oraz wirowano przez 15 minut z przyspieszeniem 13 000 g. DNA w supernatancie o małym ciężarze cząsteczkowym przeniesiono do nowego pojemnika, do którego dodano 1 µl zimnego etanolu i 25 ml pięciomolowego roztworu NaCl - całość pozostawiono w lodówce (-20 stopni C) na noc. Następnie próbkę DNA wirowano z przyspieszeniem 13 000 g przez 15 minut, suszono w próżni i ponownie zawieszono w 30 µl buforu TE. Po dodaniu 1 µl RNAzy A (50mg/ml) i 1 µl proteinazy K (25mg/ml) rozpoczęło się nieprzerwane przez godzinę trawienie enzymatyczne w wodnej łaźni w temperaturze 37 stopni C. Następnie dodano 5 µl buforu (0,5% SDS, 0,25% błękit bromfenolowy i 40% sacharoza w buforze TE) i próbka DNA została wprowadzona na 1,8% żel agarowy na 3 godziny oraz uwidoczniona w świetle ultrafioletowym. Obraz ciągu par nukleotydów DNA sfotografowano i poddano analizie komputerowej Gel-Pro (Media Cybernetics).

Analiza ilościowa fragmentacji DNA - fragmentacja DNA została określona ilościowo według opisu Matzingera zmodyfikowanego przez Rokhlina. W skrócie: 2 x 10 5 komórek inkubowano przez noc w T-25 pojemnikach z 5 µl R10 w obecności 10 mikro-kiurów tymidyny znakowanej trytem, następnie przemyto je i ponownie zawieszono w nowym R10 z gęstością komórek 0,05 x 10 do szóstej /ml. 190 µl zawiesiny komórkowej umieszczono w każdym z 96 dołków w płaskodennych płytkach w obecności 10 µl C-Med-100 w różnych stężeniach (stężenia końcowe wahały się od 0 do 100 µg/ml). Komórki hodowano przez 0, 6, 24 i 48 godzin, po czym zebrano DNA na filtrze z włókien szklanych. Pofragmentowany DNA przedostał się przez filtr, podczas gdy nietknięty DNA z żyjących komórek pozostał na nim. Znacznik radioaktywny wbudowany w DNA pozostający na filtrze został zmierzony w liczniku scyntylacyjnym. Wyniki przedstawiono jako procent kontroli w tym samym czasie pomiarowym.

Współczynnik przeżycia komórek w metodzie klonowania - zastosowana metoda jest oparta na półstałym systemie hodowli z mikromiareczkowaniem w 0,6% (stężenie wagowe) metylocelulozie i 10% osoczu płodów cielęcych. Komórki HL60 wysiano w ilości 800, 1600 i 3200 komórek na hodowlę, którą prowadzono przez 7 dni na płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania z 96 dołkami. Po 7 dniach inkubacji w warunkach standardowych kolonie powyżej 40 komórek policzono pod mikroskopem. Dane na temat przeżycia komórek poddano analizie według Gupta i innych. Współczynnik przeżycia (SF) obliczono jako wydajność płytki (PE) komórek z badaną substancją podzieloną przez PE komórek kontrolnych. PE była liczbą kolonii na dołek podzieloną przez liczbę komórek wysianych na początku.

Pęknięcia pojedynczego i podwójnego łańcucha DNA - rosnące w sposób wykładniczy komórki HL60 o gęstości 1 x 10 6 inkubowano z C-Med-100 przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni C. Około 1 x 10 do szóstej komórek ułożono bezpośrednio na filtrach poliwęglanowych o średnicy 25 mm i o rozmiarze pory 2 µm (Millipore). Ilość pęknięć w pojedynczym (SSB) i podwójnym łańcuchu (DSB) DNA obliczono przez wymywanie przez obojętne i zasadowe filtry, jak zostało to opisane przez Kohna i innych z modyfikacją niezbędną do pomiaru nieoznakowanego DNA za pomocą mikrofluorometrii.

Wyniki

Stosując metodę znakowania powstającego DNA tymidyną z trytem, stwierdzono, że C-Med-100 jest silniejszym inhibitorem proliferacji komórek HL60 i Raji niż komórek K562, z wartościami IC50 wynoszącymi odpowiednio 71, 84 i 200 µg/ml. Analiza proliferacji metodą mikromiareczkowania wykazała podobne dostrzegalne różnice w hamowaniu wzrostu komórek między HL60 (IC50=100 µg/ml) a K562 (IC50=267 µg/ml). Metoda znakowania DNA przez tymidynę jest czulsza.

Metoda klonowania - antynowotworowe działanie C-Med-100 udowodniono również metodą klonowania. Wartość IC50 w tym badaniu dla komórek HL60 wynosiła 83 µg/ml.

Indukcja apoptozy. Poprzednie badania w naszym i innych laboratoriach wykazały, że komórki HL60 są dobrym modelem do indukcji apoptozy in vitro. Posługując się tymi komórkami, odkryliśmy, że C-Med-100 może powodować opóżniony typ apoptozy. Chociaż C-Med-100 wywoływał apoptozę już po 6 godzinach w wyższych dawkach (200 i 400 µg/ml), masywna apoptoza pojawiała się dopiero po 24 do 36 godzinach inkubacji, podczas gdy klasyczne czynniki powodujące apoptozę, takie jak nadtlenek wodoru czy naświetlanie, kończyły swe działanie przed upływem tego czasu.

Apoptozę wywoływały dawki C-Med-100 od 50 do 400 µg/ml, a efekt zależny od dawki utrzymywał się do 72 godzin. W odróżnieniu od nadtlenku wodoru, który powodował apoptozę i martwicę wraz ze wzrostem czasu inkubacji, C-Med-100 nie powodował znaczącego wzrostu martwicy. Wyniki tych badań wskazują, że C-Med-100 hamuje wzrost komórek nowotworowych głównie poprzez indukcję apoptozy. Zmiany morfologiczne powstałe w wyniku apoptozy pod działaniem przez 72 godziny C-Med-100 zostały potwierdzone elektroforezą na żelu agarowym fragmentów DNA komórek HL60. W tym badaniu, wraz ze wzrostem dawki C-Med-100, można było uwidocznić typową dla apoptozy fragmentację DNA (180 par nukleotydów, 380 par lub 600 par) już przy dawce 80 µg/ml. Apoptoza stawała się jeszcze bardziej wyraźna przy dawce C-Med-100 200 µg/ml. Apoptozę poddano również ocenie ilościowej za pomocą analizy fragmentacji DNA pod działaniem C-Med-100 w komórkach HL60 i K562. Jak oczekiwano, zmiany charakterystyczne dla apoptozy były w minimalnym stopniu zauważalne w komórkach K562 podczas gdy wrażliwe komórki linii HL60 wykazywały zależną od dawki indukcję fragmentacji DNA.

Pęknięcia łańcucha DNA - uszkodzenia DNA pod działaniem C-Med-100 na drodze apoptozy zostały następnie potwierdzone przez pomiary pęknięć pojedynczego łańcucha (wymywanie zasadowe) i podwójnego łańcucha DNA (wymywanie obojętne) po 24 godzinach od zastosowania badanego środka. Jest więc jasne, że C-Med-100 indukował uszkodzenia DNA w komórkach białaczki HL60 w zależności od użytego stężenia. W dawce 200 µg/ml C-Med-100 powodował około 50% pęknięć w pojedynczym łańcuchu i około 25% pęknięć w podwójnym łańcuchu DNA.

Dyskusja

Wodne wyciągi C-Med-100 bezspornie powodują zależne od dawki zahamowanie proliferacji dwóch ludzkich linii komórkowych białaczki (K562 i HL60) oraz linii komórkowej chłoniaka (Raji), co udowodniono poprzez dwie analizy proliferacji. Zahamowanie wzrostu komórek pod wpływem C-Med-100 zostało potwierdzone metodą klonowania, która jest wzorcowym badaniem określającym cytotoksyczność indukowaną przez czynniki fizyczne (na przykład naświetlanie) i chemiczne. Wyniki te są zgodne z poprzednimi doniesieniami o zahamowaniu proliferacji komórek przez alkaloidy oksoindolowe uzyskane z Uncaria tomentosa (Willd.) DC - mechanizm działania wspomnianych związków polegał na indukcji różnicowania się w kierunku makrofagów w linii komórkowej chłoniaka U-937 i w kierunku granulocytów w linii komórkowej HL60. Jednakowoż, C-Med-100 jest wyciągiem wodnym, a alkaloidy oksoindolowe nie są zbyt dobrze rozpuszczalne w wodzie. Znacząca różnica w wartościach IC50 dla HL60 i K562 skłoniła nas do dalszych badań mechanizmu hamowania wzrostu przez roztwory C-Med-100. Jest wiadomo, że komórki HL60 są wrażliwsze na różne bodźce powodujące apoptozę, podczas gdy komórki K562 są oporniejsze. Komórki HL60, ostrej białaczki mieloblastycznej, choć pozbawione p53 mogą rozszczepiać PARP (polimerazę poliADPrybozy) na początku apoptozy, a komórki K562, przewlekłej białaczki szpikowej, nie wykazują takiej zdolności. Oporność komórek K562 na hamowanie proliferacji pod wpływem C-Med-100 potwierdziła poprzednie doniesienia o szczególnej niewrażliwości tych komórek na indukcję apoptozy przez czynniki cytotoksyczne. Dowiedliśmy zależnej od dawki C-Med-100 apoptozy w komórkach HL60 na podstawie zmian morfologicznych, fragmentacji DNA w elektroforezie i oceny ilościowej fragmentacji przez znakowanie tymidyną z trytem, oraz tego, że w komórkach K562 trudniej wywołać apoptozę pod wpływem C-Med-100. Z badań tych wynika, że C-Med-100 hamuje proliferację komórek głównie poprzez indukcję apoptozy w przeciwieństwie do nadtlenku wodoru czy naświetlania powodujących martwicę.

Ważną cechą charakterystyczną dla apoptozy wywołanej przez C-Med-100 jest jej opóźnione pojawienie się. W odróżnieniu od czynników zastosowanych jako pozytywne kontrole, czyli naświetlanie (5 Gy) i nadtlenek wodoru (50 µmoli), wywołujących maksymalną apoptozę w ciągu 24 godzin, C-Med-100 indukował apoptozę w największym stopniu dużo później (48 lub 72 godziny). Okres czasu między pierwszymi zmianami komórkowymi charakterystycznymi dla apoptozy a śmiercią komórki różni się w zależności od typu komórki i bodźca letalnego. Od chwili pojawienia się pierwszych zmian strukturalnych w komórce upływa jedynie kilka godzin do ostatniego stadium zaprogramowanej śmierci komórki oraz do jej wchłonięcia w procesie fagocytozy (faza unicestwienia). Dla większości chemioterapeutyków pojawienie się typowej apoptozy można zwykle wykryć po 3 do 24 godzin. Znane jest przynajmniej jedno doniesienie, wedle którego indukcja apoptozy pojawiła się w późniejszym okresie (maksymalny efekt obserwowano w 52-72 godziny) i była ona spowodowana przez kwas betulinowy, związek pochodzący z kory buku. W naszym badaniu pęknięcia pojedynczego i podwójnego łańcucha DNA były ściśle związane ze stężeniem C-Med-100. C-Med-100 powodował więcej SSB niż DSB, jak pokazują to wartości IC50 (SSB=226 µg/ml, DSB=377 µg/ml). Pęknięcia podwójnego łańcucha DNA (DSB) są najczęstszymi uszkodzeniami spowodowanymi przez naświetlanie czy chemioterapię, prowadzącymi do śmierci komórki nowotworowej. To, że C-Med-100 powoduje więcej pęknięć SSB niż DSB, może świadczyć o jego działaniu cytotoksycznym raczej na drodze apoptozy niż martwicy komórki, choć związek między pęknięciami łańcucha DNA a apoptozą jest skomplikowany. Fragmenty DNA w naszym badaniu były multimerami składającymi się w przybliżeniu ze 180 par nukleotydów. Fragmenty te są identyczne z powstałymi po wewnątrzjądrowym rozszczepieniu chromatyny przez endonukleazę, co daje w rezultacie ciąg małych fragmentów podwójnego łańcucha DNA - jest to jedna z cech apoptozy w elektroforezie na żelu agarozowym. Przypuszczamy, że fragmentacja DNA podczas apoptozy nie jest spowodowana cięciami enzymatycznymi, jak zakładano poprzednio, lecz jest wynikiem pęknięć pojedynczego łańcucha DNA. Choć powstawanie pęknięć w podwójnym łańcuchu DNA nasila martwicę i apoptozę komórek, w przypadku stosowania C-Med-100 DSB indukują głównie apoptozę.

Zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych nie może być w pełni wyjaśnione przez bezpośrednie uszkodzenie DNA komórkowego, ponieważ jego uszkodzenie mogło być wykryte przed pojawieniem się apoptozy wywołanej przez C-Med-100 oraz dlatego, że wartości IC50 dla pęknięć łańcucha DNA są dużo wyższe niż te, które otrzymano z analiz proliferacji komórek. Jest możliwe, że uszkodzenie DNA, niemożliwe do naprawy przez komórkę DSB, zapoczątkowuje ścieżkę, która kończy się apoptozą.

APPENDIX 2

Journal of Ethnopharmacology, 38 (1993) 63-77 Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd.

Własności mutagenne i antymutagenne Uncaria tomentosa i jej wyciągów

Renato Rizzi, Francesco Re, Antonio Bianchi, Vincenzo De Feo, Francesco de Simone, Livia Bianchi and Lucia Anna Stivala

Skrót:

Przedstawiono własności mutagenne i antymutagenne wyciągów z kory Uncaria tomentosa oraz jej frakcji rozdzielonych chromatograficznie. Wyciągi i frakcje nie wykazują działania mutagennego u szczepów Salmonella typhimurium aktywowanych lub nie metabolicznie. W badaniach in vitro wyciągi roślinne i frakcje przeciwdziałały powstawaniu mutacji pod wpływem 8-metoksy-psoralenu (8-MOP) i promieni UVA w hodowli Salmonella typhimurium TA 102. Proces powstawania mutacji w hodowli S. typhimurium TA 98 i TA 100 uległ osłabieniu pod wpływem moczu palącego, który codziennie przez 15 dni przyjmował odwar z Uncaria tomentosa.

Słowa kluczowe:

mutageneza, antymutageneza, Uncaria tomentosa

Wstęp:

Uncaria tomentosa (Willd.) DC. jest rośliną należącą do rodziny Rubiaceae i jest powszechnie znana pod nazwą “una de gato”. Roślina w postaci wodnego wyciągu z kory znalazła zastosowanie w tradycyjnej medycynie peruwiańskiej w leczeniu nowotworów, zapalenia stawów, zapalenia żołądka i pewnych chorób epidemicznych. Wykazano, że wyciągi z tej rośliny posiadają własności cytostatyczne, zapobiegające zapłodnieniu, i przeciwzapalne (Keplinger 1982). Udało się wyizolować z Uncaria tomentosa wiele alkaloidów o własnościach zwiększających fagocytozę (Wagner i inni, 1985), jak i glikozydy kwasu chinowego działające przeciwwirusowo (Cerri i inni, 1988; Aquino i inni, 1989). Niedawno badaliśmy wpływ wyciągów, frakcji i czystych glikozydów uzyskanych z Uncaria tomentosa na obrzęki wywołane karageniną (Aquino i inni, 1991). Do tej pory nie przeprowadzono żadnych innych badań farmakologicznych.

Opisano różne działanie biologiczne trójterpenosaponin (Hiller 1987). Niedawno ukazało się doniesienie o silnym działaniu przeciwnowotworowym tych związków skierowanym przeciwko rakowi Ehrlicha wywołującemu wodobrzusze (Nagamoto i inni, 1988).

Celem tego badania było określenie in vivo i in vitro własności antymutagennych kory Uncaria tomentosa, pięciu jej wyciągów i sześciu różnych frakcji uzyskanych z wyciągu chloroform/metanol. Ponieważ wiele substancji naturalnych odznacza się działaniem toksycznym i mutagennym, oceniono również toksyczność i zdolność do tworzenia mutacji badanych związków. W tym celu przeprowadzono test mikrosomalny Salmonella/mammalian na aktywowanych metabolicznie lub nie szczepach S. typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 i TA 1538. Po stwierdzeniu braku działania toksycznego i mutagennego wyciągów i frakcji uzyskanych z Uncaria tomentosa, przeprowadzono badania działania antymutagennego wyżej wspomnianych związków skierowanego przeciwko procesowi fotomutagenezy wywołanej przez 8-metoksy-psoralen (8-MOP) i naświetlanie UVA w hodowli S. typhimurium TA 102. Przeprowadzono również badania in vivo, oceniające zdolność do wywoływania mutacji u S. typhimurium TA 98 i TA 100 pod wpływem moczu palącego i niepalącego przed, podczas i po podaniu odwaru z Uncaria tomentosa.

Eksperyment

Materiał roślinny - korę Uncaria tomentosa, zebraną niedaleko Cuzco, Peru, zidentyfikował dr Edmund Szeliga z Instituto Peruano de Investigacion Fitoterapica Andina. Próbkę badanej rośliny złożono w zielniku tegoż Instytutu.

Wyciąg z rośliny - z kory suszonej na powietrzu rośliny (800 g) w temperaturze pokojowej sporządzono wyciągi w eterze naftowym, chloroformie, mieszaninie chloroformu i metanolu (9:1), metanolu i wodzie, tak że powstały pozostałości odpowiednio w ilościach 2,8 - 9,8 - 8,2 - 30,2 i 24,6 grama. Część wysuszonego wyciągu chloroform/metanol (10 g) poddano chromatografii w kolumnie Sephadex LH - 20 (80 x 4 cm) w dwugramowych partiach, stosując alkohol metylowy jako eluent. Frakcje, które wyciekły, poddano chromatografii cienkowarstwowej (SiO2) w n-BuOH / HOAc / H2O (60: 25: 15), a podobne frakcje połączono tworząc frakcje I (526 mg), II (748 mg), III (4,5 g), IV (504 mg), V (1,04 g) i VI (576 mg).

Test bakteryjny - przed rozpoczęciem badań własności mutagennych i antymutagennych, oceniono toksyczność wyciągów i frakcji w różnych stężeniach na szczepach S. typhimurium TA 98 i TA 100 poddanych aktywacji metabolicznej lub bez niej według metody zaproponowanej przez Amesa i innych (1975).

Test mutagenności - do oceny potencjalnej mutagenności badanych wyciągów i frakcji zastosowano mikrosomalny test Amesa (Salmonella/mammalian) z aktywacją metaboliczną lub bez niej (+S9, -S9). W teście użyto szczepów S. typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 i TA 1538. Badanie standardowe inkorporacji na płytce wykonano według zaleceń Amesa i innych (1975). Testowane wyciągi i frakcje rozpuszczono w dwumetylosulfotlenku (DMSO) (0,1 mg na płytkę). Do aktywacji metabolicznej szczepów zastosowano homogenat sporządzony z wątrób szczurów Sprague-Dawley (250 g) indukowanych Aroclorem 1254. Zawartość białka we frakcji IV (chloroform/metanol) wynosiła 0,6 mg na płytkę (4%). Wyniki przedstawiają średnie wartości z dwóch niezależnych eksperymentów - każdy z nich przeprowadzono 3 razy. Na podstawie wyników testu cytotoksyczności do każdego badanego wyciągu i frakcji zastosowano cztery stężenia (10, 50, 75, 100 mg na płytkę). Za substancje kontrolne negatywnie i swoiście pozytywnie posłużyły: TA 98, TA 100, TA 1537, TA 1538: doksorubicyna 4 mikrogramy na płytkę bez aktywacji metabolicznej; TA 1535: hydrazyna 500 mikrogramów na płytkę bez aktywacji metabolicznej; TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537, TA 1538: 2-acetyloaminofluoren (2 AF) 5 mikrogramów na płytkę z aktywacją metaboliczną.

Test antymutagenności in vitro - metoda była podobna do opisanej przez Jose (1979) i poprzednio zastosowana do oceny własności antymutagennych beta-karotenu i wyciągów z Rosmarinus officinalis (Santamaria i inni, 1988; Tateo i inni 1988). Komórki S. typhimurium TA 102 (szczep wrażliwy na mutageny utleniające - Ames i inni 1975) z całonocnej hodowli wirowano i ponownie zawieszono w buforze fosforanu sodowego pH 7,4. Zawiesiny przeniesiono na płytki Petriego i dodano do nich badane wyciągi i frakcje rozpuszczone w 1% DMSO. Stężenia związków przedstawiały się następująco: (1) 8-MOP, 1 mikrogram (4,6 x 10 do minus 6 mola), (2) 100 mikrogramów ze wszystkich jedenastu próbek. Karoten w dawce 100 mikrogramów zastosowano jako kontrolę zahamowania mutagenezy indukowanej przez 8-MOP (Santamaria i inni, 1988). Zawiesinę inkubowano wstępnie w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie naświetlano UVA. Żródło światła znajdowało się 12 cm nad powierzchnią hodowli. Do naświetlania użyto lampy Philips o wysokiej prężności pary HP 125 W, emitującej światło o długości fal 300-400 nm z maksymalną emisją przy długości fali 365 nm. Strumień światła filtrowano przez szkło okienne w celu uzyskania widma UVA, i mierzony w odległości 12 cm od komórek (aparaty pomiarowe UV, S. Gabriel, CA) wynosił 1 x 10 do 3 ergów/cm do minus 2 s do minus 1 (1 x 10 do minus 4 J). W stosownych odstępach czasu (0, 15 minut) naświetlane komórki (0,1 ml) dodano do 2 ml ciekłego 0,6% agaru (zawierającego 0,5 mola l-histydyny i 0,5 mola biotyny), trzymano w temperaturze 45 stopni C i umieszczono na płytkach Petriego zawierających agar Vogel o niskiej zawartości soli z glukozą. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni C policzono rewertanty (mutanty odzyskujące cechy szczepu poprzedniego) oceniając rewersję histydyny.

Test antymutagenności in vivo - dwóch zdrowych dawców (palący i niepalący) poproszono o codzienne picie odwaru z Uncaria tomentosa przez 15 dni (około 6,5 grama dziennie). Dawcy byli mężczyznami 35-letnimi - jeden z nich palił 20 papierosów dziennie od 15 lat, drugi był niepalący. Żaden z nich nie był leczony lub naświetlany przez ponad 6 miesięcy przed badaniem. U żadnego z nich nie stwierdzono infekcji wirusowych oraz nie wykazano w anamnezie rodzinnej istnienia zmian nowotworowych. Żaden z nich nie pracował w środowisku potencjalnie mutagennym lub rakotwórczym. Odwar otrzymano przez gotowanie w wodzie wysuszonej kory Uncaria tomentosa przez 3 godziny aż do chwili, gdy objętość początkowa zmniejszyła się do 1/3 zgodnie z metodą stosowaną w medycynie naturalnej. Mocz obu dawców pobrano przed i podczas 8 dni po ostatniej podaży odwaru - zagęszczano go z żywicą Amberlite XAD-2 według metody Yamasaki i innych (1977). Zastosowano trzy różne stężenia moczu (20, 50, 100 mikrolitrów). Próbki moczu dodano do szczepów S. typhimurium TA 98, TA 100 z lub bez beta-glukuronidazy według metody Amesa i innych (1975) zmodyfikowanej przez De Meo i innych (1988).

Wyniki

Test bakteryjny i mutagenności - jedenaście wyciągów i frakcji uzyskanych z Uncaria tomentosa wykazało niewielką aktywność toksyczną w teście mikrosomalnym Amesa (Salmonella/mammalian) jedynie przy stężeniu 1000 mikrogramów na płytkę. Nie stwierdzono własności mutagennych w stężeniach 10, 50, 75, 100 mikrogramów na płytkę z lub bez aktywacji metabolicznej (+S9, -S9) we wszystkich użytych szczepach.

Test antymutagenności in vitro - wszystkie wyciągi roślinne i frakcje w dawce 100 mikrogramów/ml chroniły przed fotomutagenezą wywołaną przez 8-MOP i UVA (15 minut naświetlania). Wśród 11 wyciągów stwierdzono istotne różnice w aktywności antymutagennej. Wyciągi chloroformowe i metanolowe były odpowiednio najmniej aktywnymi (27%) i najbardziej aktywnymi (59%) wyciągami. W tej samej tabeli porównano wyniki z beta-karotenem, który jest najbardziej aktywnym związkiem hamującym fotomutagenezę w 68% jak przedstawiono to wcześniej (Santamaria i inni, 1988).

Test antymutagenności in vivo - mocz niepalącego nie wykazywał własności mutagennych przed (t0), podczas (t1) i po (t2) podaniu Uncaria tomentosa. Mocz palącego miał własności mutagenne przed podaniem Uncaria tomentosa (t0). Zdolność do mutacji gwałtownie zmalała po ukończeniu podawania Uncaria tomentosa (t1) i utrzymywała się 8 dni po ukończeniu testu (t2). Podobne wyniki uzyskano w badaniu z dwoma szczepami z podaniem lub bez beta-glukuronidazy we wszystkich trzech użytych stężeniach.

Dyskusja

W ostatnim dziesięcioleciu wielkie zainteresowanie wzbudziły substancje posiadające zdolności do hamowania lub eliminowania w sposób bezpośredni lub pośredni działania mutagennego innych substancji. Nazwano te związki antymutagenami. Wiele z nich występuje w pożywieniu lub w przyrodzie (Wattenberg 1983). Związki hamujące mutagenezę obecne w pożywieniu to głównie substancje pochodzenia roślinnego o różnej budowie chemicznej (Hayatsu i inni, 1988). Jedną z najważniejszych klas antymutagenów są antyoksydanty (Osawa i inni, 1989). Udowodniono współdziałanie wolnych rodników tlenowych i aktywnych cząstek tlenu w licznych procesach patologicznych, takich jak powstawanie nowotworów czy proces starzenia (McBrien, 1982). Żródłem naturalnych antyoksydantów są warzywa, owoce, przyprawy i zioła. Wyciągi i frakcje Uncaria tomentosa wykazały się znaczącym działaniem antymutagennym, które wynika z własności antyoksydacyjnych.

Fotomutageneza pod działaniem 8-MOP przebiega w dwóch etapach: niezależnego od tlenu powstawaniu DNA-8-MOP związku fotoaddycyjnego oraz następowej reakcji zależnej od tlenu (Santamaria i inni 1988). Działanie antymutagenne Uncaria tomentosa in vitro wynika z własności antyoksydacyjnych związków zawartych w korze rośliny: dochodzi do zmiatania wolnych rodników tlenowych wytworzonych przez DNA-8-MOP związki fotoaddycyjne pod wpływem naświetlania UVA.

Podobny mechanizm może mieć miejsce w przypadku działania Uncaria tomentosa in vivo: mediatory wolnych rodników tlenowych są hamowane i nie dochodzi do przekształcenia prekarcynogenów obecnych w dymie tytoniowym w końcowe czynniki rakotwórcze.

APPENDIX 3

Centrum Badawcze Medycyny Tradycjonalnej Stowarzyszenie Naukowe bez Celów Lukratywnych Av. Insurgentes No 644-San Miguel tel. 464-1368-Lima - Peru

Informacja o wynikach stosowania Uncaria tomentosa w postaci wyciągu liofilizowanego (Manaxx)

Centrum Badawcze Medycyny Nuklearnej Akademii Nauk Medycznych Ukrainy V. Klimenko M. D. Dr. SCI., D. Bazika M. D. Dr. SCI.

Działanie promieniowania jonizującego na organizm ludzki wywołuje efekty stokastyczne i niestokastyczne. Badania stanu immunologicznego osób, które dotknęło promieniowanie jonizujące po katastrofie w Czarnobylu wykazały obecność odchyleń o charakterze przejściowym, a w innych przypadkach stałym. Nie ulega wątpliwości, że konieczne są poszukiwania właściwych metod leczenia zaburzeń odporności nabytej o charakterze stałym, jak również dla zapobiegania i zmniejszania odległych skutków promieniowania jonizującego. W celu rozwiązania tych problemów w Centrum Badawczym Medycyny Nuklearnej Akademii Nauk Medycznych Ukrainy wykonano badania na temat skuteczności działania terapeutycznego leczniczego produktu naturalnego Manaxx - liofilizowanej postaci wyciągu z Uncaria tomentosa.

1. POZIOM PODSTAWOWY SKUTECZNOŚCI PREPARATU

Manaxx jest liofilizowanym wyciągiem pochodzenia roślinnego z gatunku rośliny Una de gato (Uncaria tomentosa Willd. DC.). Produkt jest wytwarzany przez Przedsiębiorstwo Liofilizacyjne Pacyfiku S. R. LTDA. i Omniagro S. A. (Peru). Preparat został zarejestrowany na Ukrainie przez Biuro Rejestracyjne Ministerstwa Zdrowia (Certyfikat Rejestru No 2903-z 25.09.98 dla postaci farmaceutycznej - tabletki a 0,090 g - po 30 szt.).

Składniki aktywne biologicznie (Manaxx) są alkaloidami (pteropodyna, izopteropodyna, mitrafilina, izomitrafilina, rynchofilina, izorynchofilina, ukaryna), fenolami i polifenolami (katechiny, epikatechiny, proantocyjanidyny, procyjanidyny), glikozydami kwasu chinowego, trójterpenami, steroidami. Dla wspomnianych składników wykazano aktywność antymutagenną (N. M. Olejnik i wsp. 1997). Wykonano badania na pacjentach z chorobami układu nerwowego ze współistniejącymi zaburzeniami systemu odpornościowego. Wykazano immunostymulujące i przeciwwirusow (C. K. Jewtuszenko, 1996). Wykazano wzrost ogólnego poziomu komórek T, subpopulacji CD4+ i koncentracji immunoglobulin G. Otrzymano również wstępne wyniki, bardzo pozytywne, w leczeniu pacjentów, którzy cierpią na alergiczny wazomotoryczny nieżyt nosa i pacjentów po operacji krtani w przebiegu procesu nowotworowego (badania prowadzone przez N. P. Trofimenko, 1997). Wstępne wyniki otrzymane w Departamencie Hematologii Centrum Badawczego Medycyny Nuklearnej Akademii Nauk Medycznych Ukrainy również podają dane o poprawie ogólnego stanu pacjentów i zmniejszeniu się postępu w procesach białaczkowych (V. I. Klimenko, 1997). Powyższe badania stanowią podstawę teoretyczną klinicznego stosowania preparatu Manaxx.

2. CELE I METODY BADAWCZE

Obserwowano 39 pacjentów, którym podano preparat Manaxx. Z tego 25 chorych, którzy ponieśli konsekwencje katastrofy elektrowni atomowej w Czernobylu. Wśród nich było 21 mężczyzn i 4 kobiety. Manaxx był również podawany 8 chorym cierpiącym na postępującą przewlekłą białaczkę limfatyczną trzeciego stopnia (LLC). Zlecenie preparatu chorym, którzy cierpieli na LLC zostało poprzedzone cyklami polichemioterapii powtarzanej. Ostatnie cykle terapii preparatami cytostatycznymi nie dały oczekiwanych efektów. Grupa kontrolna składała się z sześciu zdrowych osób, które na ochotnika przyjęły preparat. Grupę kontrolną stanowiło pięciu pacjentów, którzy byli badani w tym samym czasie dla wykluczenia wpływu czynników środowiskowych. Dane o badanych grupach, które przyjęto dla oceny skuteczności preparatu przedstawiono w tabeli nr 1.

Grupy pacjentów obserwowanych dla ustalenia skuteczności działania naturalnego środka leczniczego Manaxx

Dawkowanie preparatu było zgodne z zaleceniami Ukraińskiego Komitetu Farmakologicznego. Wzięto pod uwagę wnioski specjalistów, dane badań klinicznych oraz wyniki badań laboratoryjnych.

Badania immunologiczne wykonano zgodnie z zaleceniami wydanymi dla badania osób ofiar czynników środowiskowych (Instytut Naukowy Immunologii, Moskwa 1989) i promieniowania jonizującego (CCMR AC Ukrainy, Kijów 1995).

Określenie subpopulacji limfocytów wykonano przy pomocy bieżącej analizy cytometrycznej fenotypu powierzchniowego.

DR. G1 cyklu.

Określenie zaburzeń stadiów różnicowania wykonano poprzez:

1. Liczbę komórek w stadium różnicowania wewnątrzgrasicznego (CD4 +, CD8 +, CD1 C+).

2. Pre - B (CD 10+19+21+) i limfocytów B (pierwotne) (CD5 +20+).

3. Określenie komórek przedgrasiczych (CD4 2+3-4-8-).

Badania zostały wykonane laserowym cytometrem przepływowym FAC-SCAN (Becton Dickinson, USA) w warunkach liniowej amplifikacji sygnałów FSC i SSC i log F11 i F12. Opracowanie matematyczne danych wstępnych i odróżniania monocytów, wykonano przy pomocy programu LYSYS II na komputerach HP 340 (Hewllett Packard, USA).

Badanie cytofluorymetryczne wykonano przy pomocy metody bezpośredniej immunofluorescencji przy pomocy paneli przeciwciał monoklonalnych Leu fimy Becton Dickinson (USA). Zestaw IMK+ zawierał MKAT dla dwubarwnej analizy jednojądrowych komórek oznaczonych FITC lub PE, zawierając anty-Leu M3 (CD4) i anty CD45 dla odróżnienia ich od limfocytów, monocytów i granulocytów, kontrolnych przeciwciał i kombinacji MKAT, anty-Leu 4-FITC (CD3) i anty-Leu 12 (CH19), w trzech etapach, dla ogólnej liczby komórek T i B. Anty-Leu 4-FITC (CD3) i anty-HLA-DR-PE dla wyszukania komórek T stałych i aktywnych. Anty-Leu 3A-FITC (CD4) i anty-Leu 2-PE (CD8) dla oceny podstawowych regulujących subpopulacji. Anty-Leu 3-PE (CD4) i anty-Leu 11-PE (CD16) i any-Leu 19-PE (CD56) dla oceny subpopulacji limfocytów efektorowych cytotoksycznych i naturalnych kilerów. Dla celów kontrolnych w badaniach użyto mikrosfer fluorescencyjnych “calibrite” (Becton Dickinson, USA) oznaczonych FITC o PC, MKAC dla immunoglobulin szczurów (FITC+PE).

Mutacje somatyczne limfocytów określono metodą Akiyama i inni (1995), przy pomocy liczby limfocytów CD4, które zniszczyły receptory komórkowe T.

Stan aktywacji limfocytów był oceniany poprzez liczbę komórek, które miały w swoich błonach aktywacyjnych - receptory interleukiny-2 (CD25), receptory dla transferyny CD71 i antygeny HLADR. Koncentracja immunoglobulin IgG, IgA, IgM w surowicy krwi była badana metodą Mancini i inni. (1965).

Analiza statystyczna materiału została opracowana przy pomocy metod parametrycznych i nieparametrycznych programu STATISTICA (wersja 2.6) w komputerach PC 486.

3. WYNIKI STOSOWANIA Manaxx

Stałe zaburzenia immunologiczne pierwszej grupy 25 osób wykazały zmianę ilości limfocytów T i limfocytów B oraz ich zawartość subpopulacyjną, jak również zaburzenia zdolności aktywacji subpopulacji. 17 osób z pierwszej grupy wykazało również stałe zmiany we wskaźnikach krwi obwodowej: leukopenia, leukocytoza, limfocytoza. Te zmiany były obecne przez 2 do 3 lat. U podstawy tych zmian we wskaźnikach laboratoryjnych, u 10 osób stwierdzono stałe epizody infekcyjne takie jak tracheobronchity, zapalenia płuc, chroniczne procesy zapalne nosogardzieli ze stanami podgorączkowymi i ogólnym osłabieniem. W terapii tych schorzeń zastosowano preparaty antybakteryjne, które pozwoliły zmniejszyć w krótkim czasie objawy tych chorób. Trzeba zaznaczyć, że u 5 osób stwierdzono przewlekłe obturacyjne zapalenie oskrzeli. Wszystkim chorym w okresie od 25 do 30 dni zalecono Manaxx 3x dziennie po 1 tabletce. Wszyscy pacjenci tolerowali dobrze ten preparat, nie zanotowano żadnego epizodu powikłań narządowych ani układowych. W czasie leczenia Manaxxem wszystkie procesy jamy nosowogardłowej zostały wyleczone. Nie wystąpiło zaostrzenie procesów infekcyjnych w oskrzelach ani w płucach (zapalenie oskrzeli, zapalenie płuc). Nie obserwowano również innych ostrych schorzeń układu oddechowego. Temperatura ciała pacjentów normalizowała się, w czasie ostatnich 2 tygodni leczenia Manaxxem była w granicach normy. Wszyscy pacjenci prosili o przedłużenie leczenia Manaxxem dlatego, że w czasie jego stosowania poprawiła się jakość ich życia, a w ostatnim miesiącu w sposób bardziej wyraźny.

Dynamika zmian wskaźników odporności komórkowej pacjentów z wtórnymi zaburzeniami układu immunologicznego, którzy ucierpieli na skutek katastrofy elektrowni atomowej w Czarnobylu

Dynamika zmian wskaźników odporności humoralnej pacjentów z zaburzeniami immunologicznymi wtórnymi, które ucierpiały z powodu katastrofy elektrowni atomowej w Czarnobylu

Wyniki leczenia preparatem Manaxx wykazują znaczące i statystycznie istotne pozytywne zmiany reprezentatywne we wskaźnikach zawartości komórek T cytotoksycznych i limfocytów naturalnych kilerów. W łańcuchu B zmniejszyła się ogólna ilość komórek, którym towarzyszyła znaczna redukcja immunoglobulin pierwotnej odpowiedzi z normalizacją średniej koncentracji immunoglobuliny A. Dla wykonania badań na temat efektywności Manaxxu w zależności od typu zaburzenia systemu immunologicznego, pacjentów podzielono na 2 podgrupy.

W pierwszej podgrupie było 10 pacjentów z aktywacją systemu immunologicznego, u których stwierdzono wysoki poziom CD3 limfocytów T, pomocniczych komórek T i wzrost stosunku CD3 do CD8 w subpopulacjach limfocytów T (pacjent nr 1, 3, 5,12, 13,15, 19, 20, 21, 23).

Zmianom w łańcuchu T towarzyszył miarodajny wzrost immunoglobulin G i M w surowicy krwi w porównaniu z drugą podgrupą.

W drugiej podgrupie charakterystyczna była depresja łańcucha T, z bardzo niskimi wartościami ilości limfocytów T, pomocniczych T i stosunek CD3 do CD8 (pacjent 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 16, 17, 18, 22, 24, 25). Średnia zawartość supresorów T w podgrupach nie zmieniła się przy różnych zmianach indywidualnych uwzględnionych w pierwszej grupie. Nie określono do momentu wprowadzenia terapii różnicy średniej liczby limfocytów B w drugiej podgrupie, przy indywidualnych zmianach wskaźników. Wystąpiły bardzo niskie średnie.

Analizy wykazały, że stosowanie Manaxxu prowadzi do różnych zmian w liczbie limfocytów T zależnych od ich ilości początkowej. W ten sposób w pierwszej podgrupie określano nieznaczny spadek wskaźników, a w tym samym czasie w drugiej podgrupie obserwowano ich wzrost. We wszystkich ocena różnic indywidualnych była znaczna. Analogicznie w drugiej podgrupie zaobserwowano wzrost liczby helperów T. Liczba supresorów T nie zmieniła się. W łańcuchu B stwierdzono normalizację liczby limfocytów CD19+, zmniejszyła się różnica ilości immunoglobulin surowicy krwi. We wszystkich rodzajach immunoglobulin zaobserwowano zmniejszenie się indywidualnych różnic.

Badania antygenów aktywizujących wykazały obniżenie się (w porównaniu ze wskaźnikami początkowymi) antygenów aktywizujących - receptory transferyny, interleukiny-2, antygenów HLA-DR. Po leczeniu Manaxxem wskaźniki pacjentów leczonych nie różniły się wyraźnie od wskaźników grupy osób praktycznie zdrowych, które również brały preparat. Po aktywacji mutagenów wyraźna była tendencja do normalizacji odpowiedzi mutagenozależnej, zarówno dla subpopulacji limfocytarnych, jak dla innych subpopulacji - CD3+, CD4+, CD8+, CD57+, HLADR+.

Badania mutacji somatycznych w miejscu komórkowego receptora T - nie stwierdzono efektów negatywnych przy stosowaniu preparatu w procesie mutagennym po zastosowaniu promieniowania jonizującego. Liczba nieprawidłowych limfocytów CD3-4+ w obserwowanych grupach nie przekroczała wartości normalnych.

Ilość limfocytów CD3-4+ z aberracjami w obserwowanych grupach podczas leczenia naturalnym produktem leczniczym Manaxx. Badania pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną, LLC (grupa 2).

Manaxx był zlecony 8 chorym z LLC w trzecim stadium . Zalecenie preparatu chorym na LLC poprzedzono leczeniem polichemioterapeutycznym, powtarzanym. Ostatnia terapia preparatami cytostatycznymi nie dała oczekiwanych efektów.

Chorzy byli w stanie średniociężkim. Zlecono im Manaxx 2 tabletki 3x dziennie. 4 chorych przyjmowało Manaxx przez 4,5 miesiąca. Pozostali przez 3 miesiące. Pacjenci dobrze tolerowali preparat. W czasie podawania preparatu stan chorych ustabilizował się, temperatura ciała wróciła do normy, nie było epizodów infekcyjnych. Wskaźniki w zakresie liczby krwinek czerwonych miały tendencję do poprawy, liczba leukocytów nie wzrosła. Leczenie Manaxxem było kontynuowane po zakończeniu badań.

Ustalono wskaźniki immunologiczne u osób zdrowych i chorych na LLC.

Indywidualna dynamika różnic względnych ilości komórek białaczkowych ze wskaźnikami immunologicznymi w czasie podawania naturalnego produktu leczniczego Manaxx

Manaxx nie ma ujemnego działania na proces białaczkowy, nie wywołuje stymulacji proliferacji klonów białaczkowych. W procesie leczenia tym preparatem zanotowano zmniejszenie się liczby wczesnych postaci białaczkowych, które zawierały antygen limfoblastycznej ostrej białaczki (CD10) i komórki B typowe dla LLC z antygenem CD5. Mimo że zaobserwowano wysoką liczbę limfocytów B we wszystkich populacjach, u chorych zaobserwowano wzrost komórek B dojrzałych z fenotypem CD19+20+22. W badaniach wykonanych na pacjentach z antygenem aktywizującym stwierdzono zmniejszenie się ich aktywności w komórkach białaczkowych. Wykazuje to, że Manaxx u chorych, którzy cierpieli na LLC ma efekt różnicujący. Wyniki znajdują się w tabeli 6.

Wyniki badań populacji resztkowych normalnych limfocytów u pacjentów z LLC w czasie podawania naturalnego produktu leczniczego Manaxx

Sstosowanie preparatu doprowadzilo do nowego rozmieszczenia subpopulacji komórek T z normalizacją stosunku pomiędzy subpopulacją regulującą i liczbą naturalnych kilerów. W tym samym czasie zaobserwowano zmniejszenie się liczby komórek T aktywowanych.

Wyniki oznaczania ilości limfocytów T niedojrzałych w populacji limfocytów normalnych resztkowych obecnych u pajentów z LLC podczas podawania naturalnego produktu leczniczego Manaxx

Przedstawione wyniki potwierdzają obecność efektu różnicującego preparatu w łańcuchu T układu immunologicznego.

WNIOSKI

1. Badania kliniczne pacjentów z zaburzeniami układu immunologicznego i hemopoezy pacjentów, którzy ponieśli skutki katastrofy elektrowni atomowej w Czarnobylu wykazują dobrą tolerancję na preparat i brak komplikacji w przebiegu jego podawania w dawce 480 mg dziennie oraz działanie przeciwzapalne.

2. Manaxx wywołuje efekt immunotropowy, który objawia się w aktywacji, jak również w depresji systemu immunologicznego. Preparat wpływa na różnicowanie limfocytów, co potwierdza się efektami wpływającymi na CD3 połączone z receptorami panmitogennymi. Zmniejszanie się znaczenia wstępnego określiło korelację, częstość zmian i inne obniżanie się wskaźników, co jest wspólne dla działania

3. Po leczeni tym preparatem

4. Badania wykonane na temat mutacji somatycznych w

5. Badania kliniczne pacjentów z LLC w

6. Wśród pacjentów ze stałymi zaburzeniami układu immunologicznego i hemopoezy, obserwowano tendencję do normalizacji odpowiedzi mitogenozależnych, jak również populacji wszystkich limfocytów i innych subpopulacji. komórce T receptora nie wykazały negatywnego działania preparatu w promieniowaniu jonizującym procesu mutagenicznego. Liczba limfocytów CD3-4+ z aberracjami w ramach badanych grup nie przekroczyła normalnego poziomu . trzecim stadium postępującym, w czasie trzymiesięcznego przyjmowania Manaxxu w dawkach 960 mg dziennie wykazały, że jest dobrze tolerowany, stabilizuje stan chorych. Epizody infekcyjne i inne komplikacje nie występowały. Stosowanie Manaxxu przedłużono. niki badań Manaxxu u chorych z LLC wykazują wzrost liczby limfocytów B dojrzałych i tendencję do normalizacji resztkowych komórek T.

Opracowały: H. Hajduga-Sereda, K.Żurowska